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提高分子诊断的质量控制

分子诊断能避免质量问题吗?他们需要质量控制吗?在这个新的测试领域,方法和制造商一直在主张他们与传统测试实践的“区别”,同时在开发任何新的和不同的质量实践方面进展缓慢。客座作者Clark Rundell博士解释说,可以采用“传统”QC协议来解决分子检测质量保证方面的差距。[转载自IVD Technology杂志]


经许可转载IVD技术杂志,2008年11月号

作者:Clark A. Rundell博士

与其他实验室学科相比,我国在质量控制(QC)实践方面的技术水平相对较低
分子诊断测试已经落后。分子诊断检测的质量控制面临以下挑战:
新的和快速发展的技术,对一生一次的基因检测的准确性的高期望,缺乏质量控制材料,缺乏定量检测系统输出,以及几乎每天都有新的基因检测目标出现。面对这些问题,临床实验室正在努力为他们进行的分子诊断测试制定适当的质量保证计划。

此外,立法和政府政策有可能将基因检测的监督力度提高到实验室医学从未见过的水平(例如,参议员爱德华·肯尼迪(D-MA)和当时的参议员巴拉克·奥巴马(D-IL)提出的法案,FDA关于体外诊断多变量指数测定(IVDMIA)的指导,以及秘书遗传、健康和社会咨询委员会(SACGHS)的建议)。[1]分子检测的准确性目前尚不清楚,但对分子诊断质量的担忧只有在获得有关这种准确性的数据后才能得到解决。虽然监测分子检测系统输出和统计分析提供了获得准确性和精密度数据的好方法,但这种传统的QC策略在分子诊断中扎根缓慢。

材料与监控

实验室人员的经验和知识、QC材料的可用性、测试系统的能力、
测试成本和法规要求对当前QC实践有影响。用最早的分子测试
这是手工完成的,结果是通过解释凝胶上是否存在条带来确定的。这样的测试通常是由研究人员在传统的QC技术和QC经验最少的
材料由先前测试过的患者样本组成。对系统错误的监视被认为是不必要的,因为测试失败很容易被检测到。此外,由于QC材料是可变的,实验室不知道波段强度的变化是否意味着酶正在降解或所选的患者对照样品中不含有足够的DNA。一旦发生故障,实验室需要排除故障并重新测试所有患者样本。尽管这样做的成本是一天的工作,但试剂价格低廉,而且系统易于故障排除。

分子测试系统现在更加复杂和昂贵。因为基因分子检测的样本很贵
每个至少40美元,重新检测是个大问题。使用均质QC材料的传统QC做法
是否可用于分子诊断,在实际生产前识别降解或有缺陷的系统组件
测试失败。面对QC材料有限的商业可用性,一些实验室还汇集患者样本以创建此类材料的可重复来源。[2]此外,新的分子系统具有定量输出,例如荧光(信号强度)或等位基因比率,可以跟踪以反映测试系统的性能。对一段时间内的质量控制结果进行统计分析,可以确定预期的变化。这样的结果可以连续绘制在列维-詹宁斯图上,以监测测试系统的变化或趋势。Westgard规则也可以应用于确定何时应该采取纠正措施以防止测试失败。[3]

多路测试的QC挑战

比成本更大的问题是,由于新的多路测试系统的复杂性,可能会出现未被发现的错误。
即使结果仍然是“是”或“不是”。测试结果由系统软件确定的算法自动计算。该算法提供了一个定量的输出,考虑到探针,引物,酶的独特反应,并为每个等位基因报告的背景。然而,多路测试中的一个系统组件可能会扭曲算法,从而在没有错误标志的情况下进行错误的基因型调用。此外,报告的等位基因中可能只有一个或两个对特定的系统成分敏感,而其他的对不同的成分敏感。如果在一次运行中只监视几个报告的等位基因,则可能无法检测到错误的测试结果。

在每次患者样本运行中,目前的多重检测的QC实践包括检测两到三个QC样本,
每个最多代表两个等位基因。如有可能,应旋转含有不同等位基因的QC样品
因此,随着时间的推移,测试中检测到的大多数突变都会被反映出来。然而,这种做法并不能确保在每次运行中都能正确检测到多重测试的所有等位基因。可以采用传统的质量控制方法,使用相似基因型的合并患者样本来监测检测两种或三种基因型的测试(例如,血栓形成风险)
等位基因。但监测囊性纤维化23-plex测试以准确检测所有突变是不可能的
只有病人的样本。在这种情况下,传统的QC实践需要同质的多重控制。虽然目前有两种商业对照可用于囊性纤维化测定,但需要更多的多重对照。

更有问题的是预测疾病或治疗的微阵列测试或大型多重测试面板。它
很难想象设计一种QC材料来监测每个样品报告100个或更多结果的测试。阵列制造商努力通过构建冗余来提供有效的结果。然而,这种冗余并不能保证准确性,也不能提供一种在日常使用过程中监控和分析所有系统组件的方法。尽管传统的QC实践可能需要对阵列测试系统进行修改,但同样适用以下原则:采用传统的QC实践进行多重测试以及QC统计分析的自动化可能会指导复杂微阵列QC的发展。

检测和预防错误

疾控中心的一份报告发现,分子诊断测试的错误率在很大程度上是未知的。[4]数量有限的
分子诊断的能力测试(PT)数据为评估实验室错误提供了唯一可用的信息。2002年美国PT数据和2001年欧盟PT数据显示,0.1-3%的实验室在分子诊断熟练度样本上存在错误。[5,6]根据美国病理学家学会(CAP;诺斯菲尔德,伊利诺伊州)项目,高达2%的实验室有分析错误的分子血栓形成风险分析,或MTHFR测试,对某些熟练程度的样品。对于多重囊性纤维化筛查试验,约4%的实验室在一些熟练样本上存在分析错误。一项涉及具有罕见基因型的多重对照的实验熟练度研究显示出更高的误差
率。[7]本研究中错误的原因包括未能检测到突变,多态性导致检测特定序列的干扰,实验室人员对数据的误解以及报告结果的各种错误。

这些研究的参与者人数少,一些熟练度样本与某些特定的不相容
分子测试技术阻碍了从PT数据中得出结论。此外,
分子测试系统一直无法做出全面的精度和准确性要求,因为他们缺乏
对于许多等位基因,他们的系统设计用于检测足够的均匀QC材料。因此,数据
预测分子诊断检测中发生的误差的大小是不够的。

目前基因检测的质量控制实践在检测和防止错误方面能力有限。对罕见突变的检测可能永远不会进行质量评估,因此不可能制定预防错误的策略,甚至不可能估计检测这些等位基因的错误率。对于常规运行质量控制的更常见的等位基因,通常不进行绘制和分析数据以进行误差预测。此外,每次运行轮换2-3个对照并不能产生足够的数据,说明检测未包括在对照中的基因型的准确性。表一列举了用于临床化学实验室的传统优质资源和做法与用于分子诊断测试的资源和做法的比较。

质量控制项目 传统化学测试 分子诊断测验
质量控制数据的统计分析 是的,广泛使用 大多没有实践过
用于主动错误预防的QC数据 是的,广泛使用 大多不使用
使用中的自动化测试 是的,广泛使用 对于新系统是这样的
检验的稳健性 测试大多是健壮的 鲁棒性尚未验证
QC软件可用于每种类型的测试 是的 选择很少
软件适用于各种测试范例 是的 没有
多种选择 是-有几个选项 有限的选择
定义了医学上允许的误差 对许多分析师来说是这样的 没有
大多数测试或基因型的错误率是已知的 对大多数分析者来说是肯定的 突变基因型没有
用于质量控制和性能监控的数字数据 是的,随处可见 没有
由QC软件捕获和使用的数字数据 是的,广泛使用 大多没有实践过
标准参考材料可从NIST 对许多分析师来说是这样的 主要是不
质量控制,熟练程度和可用的参考材料 是的
大多数分析物或基因型检测的覆盖率 是的 没有
法律要求参加能力测试 是的 没有
能力测试程序可用于大多数分析 是的 没有
方法#熟练程度测试代替具体测试 没有 是的,测序测试。
以方法为基础的质量控制代替所有分析物的单独评估。 没有 部分且未验证。最终方案还处于开发阶段。

为了解决分子诊断质量保证中的质量缺口,可以从常规临床中采用方案
化学实验室。传统上,由测试同质对照样本产生的定量数据是
对变化和趋势进行监控和统计分析,以便在失败之前发现潜在的测试性能问题
发生。除了大量病毒学检测外,这种方法对分子诊断实验室来说是新的。然而,思想领袖和分子测试的早期采用者开始使用这样的协议。[2]

实验室通常从临床和实验室等来源转向已发表的文件
标准学会;Wayne, PA)和Westgard QC(麦迪逊,WI)提供验证新测试的指导
建立质量控制协议。虽然目前没有CLSI文件专门针对QC协议
对于分子检测,一些标准和准则仍然是有用的,包括
《定性检测性能评价(EP12-A2)》和《多重核酸的验证与确认》
化验(MM-17A)。”EP12-A2介绍了评价定性测试的重要理论和统计技术。
MM-17A包含验证多路测试的指导方针,并描述了参考材料的几个来源。

收集数据应用于QC协议是方便的数字系统输出包括在大多数
新的分子测试系统。该软件由IVD制造商内置,用于收集和显示QC
数据对分子诊断是有益的,特别是对于可能需要69个数据图表来监测的23个等位基因测试
所有野生型,杂合子和突变信号。Cepheid (Sunnyvale, CA)的GeneXpert就是一个例子
分子检测系统具有QC数据采集和显示功能。内置软件,通过Westgard规则等技术对QC数据进行统计分析,确定行动点,是提高分子检测QC的关键因素。[3]

采购及管制物料

然而,分子检测的对照材料的缺乏阻碍了传统QC方法的采用。
作为回应,一些公司已经开始开发和生产基因检测的控制装置。而且,尽管
越来越多的国内和国际来源的特征细胞系参考物质往往不是
质量控制的同质来源,它们用于验证测试系统检测特定遗传变异的能力。[9,10,11]例如,疾病预防控制中心基因检测参考物质协调项目维护着分子诊断质量控制和参考物质的来源列表。

尽管有这些资源,大多数分子检测仍然缺乏对传统QC有用的质量控制
实践。从历史上看,只有在实施了新的测试并在一定程度上标准化之后,才会开发质量控制。可以理解的是,大多数IVD制造商更喜欢销售高价产品的测试平台。与其他实验室学科相比,分子测试方法不断变化,使得控制制造商难以开发与当前和未来测试系统兼容的产品。此外,对当前商业多路控制的反应一直不温不火。使用免费患者样本或根本没有样本的实验室不愿支付控制费用。监测定性试验以防止失败的价值尚未证明适用于分子试验。所有等位基因的检测结果都没有被监测,因此失败率是未知的。

法例及规例

临床实验室改进修正案(CLIA)是为了回应对实验室的关注而编写的
质量。根据CMS的数据,2007年12月,CLIA覆盖了203939个实验室,估计占总数的3%
这些实验室可以进行分子诊断测试。[12]分子诊断实验室主任与CLIA下的其他主任负有相同的责任,以确保检测系统为其预期用途提供足够质量的结果。CMS认为CAP是一个检查机构,它提供了特定质量相关活动的分子病理学检查表和认证所需的文件。CDC和SACGHS最近建议加强对分子诊断的监督,并对分子PT提出更严格的要求,这表明该领域的未来法规。[1,4]

FDA还在调节分子诊断方面发挥作用,包括监管实验室开发的权威
测试(LDT)。迄今为止,该机构通过执法自由裁量权选择不对ldt进行监管。然而,尽管FDA宣布无意监管单个ldt,但已决定监管IVDMIA器械,复合物
分析结果基于不透明的算法,其中一些是开发内部使用的单一
临床实验室。一个为期18个月的ivdmia监管阶段将很快开始。这将是该机构的
第一次尝试监管ldt。

实验室的资源已经捉襟见肘,他们不希望增加监管。一个更好的
确保质量的方法是自愿执行CLSI指南。特别是新的CLSI指南
详细介绍传统QC原理和统计技术在分子检测中的应用
理想。

结论

要使分子质量控制实践达到与其他实验室学科相同的水平,需要以下要素:确定错误率,检测系统输出的可用性,用于监控每个测试系统,采用
用于监控系统性能以防止故障的传统QC协议,用于生成系统监控和错误预防数据的QC材料,用于分子测试的熟练程度要求和样品,以及用于促进QC策略的内置软件。

由于独特的困难挑战,分子诊断的良好质量控制实践比其他实验室学科需要更长的时间来发展。不幸的是,不准确的基因检测结果可能对患者及其家属产生严重影响。然而,通过继续合作,IVD行业和实验室社区可以改善分子质量控制实践,以促进良好的药物和避免繁琐的立法。

参考文献

  1. 美国遗传、健康和社会秘书咨询委员会(SACGHS)基因检测监督系统:对卫生和人类服务部长指控的回应,”2008年4月;可从互联网下载:http://www4.od.nih.gov/oba/sacghs/reports/SACGHS_oversight_report.pdf
  2. 梁思等,“传统临床病理质量控制技术在分子病理学中的应用”,《分子诊断杂志》第10期。2(2008): 142-146。
  3. JO Westgard,基本质量控制实践,[编辑,第3版]。(麦迪逊,威斯康辛:Westgard QC Inc.,[编辑。2010])。
  4. 疾病控制和预防中心,实验室系统工作组,“美国临床实验室能力测试服务审查:技术工作组的最终报告”,2008年4月;可从互联网下载:www.futurelabmedicine.org/Reports/2007_PT_Report_080320_rev_FINAL.pdf。
  5. 疾病控制和预防中心,国家公共卫生基因组学办公室,“基因测试审查草案:囊性纤维化分析有效性”,2007年11月;可从互联网下载:http://www.cdc.gov/genomics/gtesting/acce/FBR/CF/CFAnaVal.htm。
  6. E Dequeker et al.,“分子基因检测的质量控制”,Nature Reviews Genetics,第9期。2(2001): 717-723。
  7. S Berwouts等人,“欧洲囊性纤维化外部质量评估方案中合成质量控制材料的评价和使用”,《人类突变》,2008年5月9日。
  8. JO Westgard et al.,“用于改善临床化学质量控制的联合shehart -cusum控制图”,《临床化学》23期,no。10(1977): 1881-1887。
  9. 疾病控制和预防中心,“基因检测参考材料协调计划”,2007年11月;可从互联网下载:http://www.cdc.gov/dls/genetics/rmmaterials/default.aspx。
  10. 国家标准技术研究院,《标准参考物质目录》,2008年9月;可从互联网下载:srmors.nist.gov/tables/view_table.cfm?table=105-8.htm。
  11. EuroGentest,“质量控制和参考材料生产商网站”,2008年4月;可从互联网下载:www.eurogentest.org/web/info/public/unit1/reference_materials/rm_databases.xhtml#databases
  12. 疾病控制和预防中心,“检验医学:国家现状报告”,2008年5月;可从互联网下载:http://www.futurelabmedicine.org/reports/chapter_ii_-_market_profile.pdf。

作者简介:

Clark A. Rundell是缅因州分子质量控制公司(Scarborough, ME)负责研究的副总裁。可以联系到他此电子邮件地址被保护免受垃圾邮件机器人。您需要启用JavaScript才能查看它。

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