稳定性测试和CLSI EP25-A

新的CLSI指南已经提出了计算和解释IVD试剂稳定性的最佳方法的建议。我们很高兴地介绍制定指南的CLSI小组委员会主席James Pierson-Perry的一篇文章，介绍了这些概念和新的建议。

IVD试剂的稳定性测试:介绍CLSI EP25-A

詹姆斯Pierson-Perry
高级重点专家-生物化学
全球检测发展
西门子医疗诊断

“制药法”
产品稳定性测试的要素
稳定性研究的类型
稳定性试验计划
测量漂移示例
加速稳定性测试呢?
参考文献

偏倚、不精确和稳定性是体外诊断(IVD)试剂大多数分析性能属性的基本组成部分。其中，制造商和实验室科学家都很清楚偏见和不精确。有国际公认的确立其主张的议定书^1，2性能验证是在临床实验室例行进行的。

相比之下，稳定性在制造商和用户之间的含义差异更大。这在很大程度上是因为稳定性不是一个直接测量的特性，而是被理解为产品保持其规定的成分、性质和性能的能力。因此，产品的稳定性声明取决于制造商在一段时间内评估了哪些特定的产品属性。稳定性声明通常由用户从产品的使用说明中接受，并且仅通过长期质量控制行为或类似数据在实验室中间接验证。

在本讨论中，IVD试剂包括用于诊断测试的最终用途产品，如试剂盒、校准器、对照材料、样品稀释剂等。这类产品的基本稳定性声明是保质期——产品在制造商推荐的储存条件下保持可使用的时间——和使用寿命——产品投入使用后保持可使用的时间(例如，打开的对照材料小瓶，试剂盒的校准间隔等)。

“制药法”

关于IVD试剂的偏倚和不精确性评估，有大量的文献报告和监管指导文件。然而，关于稳定性评估的类似资料却少得多。在美国，FDA要求IVD试剂制造商将稳定性信息作为其产品标签的一部分^3.但没有就如何建立这样的主张提供直接指导。相反，制造商被引导到管理药品和原料药的法规中，以获取关于建立稳定性声明的信息⁴．

与IVD试剂相比，制药行业在稳定性、实验设计、数据分析和开展研究的实际考虑方面有大量的文献。从这些知识中获得的主要教训收集在一系列国际公认的指导文件中:人用药品注册技术要求统一国际会议。^5、6

2002年，欧洲标准化委员会发布了解决IVD试剂稳定性测试需求的共识标准。本标准为EN 13640⁷，纳入了制药指导文件中的最佳实践，以提供有关IVD试剂所需的术语、稳定性声明类型以及建立此类声明的要求的高级信息。

最近，CLSI发布了EP25-A:体外诊断试剂的稳定性评估。⁸本文件提供了EN 13640和ICH标准中概念的实际实施，供制造商用于建立IVD试剂的稳定性声明。

产品稳定性测试的要素

虽然有可能通过测试所有产品属性来建立稳定性声明，但更实际的方法是只测试那些被确定为关键属性的产品。这导致了基于三个要素的产品特定稳定性定义:

选择要测试的“关键”产品属性
相关验收标准的说明
说明所需的统计置信度和分析能力

在期望的统计置信度范围内，所有关键属性满足其接受标准的时间段被视为产品稳定性持续时间。由于该定义的组成部分在不同的产品中差异很大，因此没有一个测试协议是合适的。

应选择在储存和使用期间最有可能揭示产品质量、安全性和功效的潜在重大变化的关键属性。制造商可以选择从物理、化学、生物、微生物特性以及分析性能指标中提取。

最常见的关键属性之一是分析物的测量量随时间的明显变化，称为测量漂移。这可用于评估浓度的实际变化(例如，对照产品或校准器)或方法的测量偏差随时间的变化(例如，校准间隔)。这些变化可以在绝对基础上测量，也可以在相对基础上测量，参考在假定稳定条件下保持的产品。

关键属性的合适验收标准可能来自多个来源:产品设计输入要求、方法的既定质量目标(例如，CLIA, RiliBÄK)、类似产品的历史数据等。通常，将使用多个测试样本来评估方法范围内的分析性能属性。在这些情况下，任何一个样品的最小稳定持续时间应作为该产品批次的总体稳定持续时间。

CLSI EP25-A要求建立稳定性估计是基于统计置信度和创建实验方案和后续数据分析的能力的考虑。应该选择重复的次数和测试点的时间，以便从结果的可变性中充分辨别趋势。

稳定性研究的类型

EN 13640和CLSI EP25-A都描述了对不同类型产品稳定性测试的需求。保质期研究用于在规定的储存条件下确定IVD试剂在最终包装中的有效期。这表示从产品制造到可用性的最后一天的间隔-无论它是否实际投入使用。指导文件要求使用三个产品批号来建立保质期声明。

相反，使用中权利要求规定了产品在投入使用后保持合适的时间段。此类权利要求的示例包括控制产品在首次打开后可以使用的持续时间或在需要常规重新校准之前可以使用的方法。一个单一的产品批次可以用来建立这些声明，但明智的做法是使用更多。

第三种类型的测试被称为运输模拟，或者更简单地说，压力测试。这些研究包括将样品产品暴露在一系列预先确定的环境条件变化中(例如，温度、湿度、光照等)，以模拟产品在客户收到之前的分销周期中可能承受的最坏情况。此类研究的结果有助于确定产品的适当运输和处理条件。所使用的压力测试条件可能来自制造商自己对实际产品分布的研究或来自ASTM:D4169-05等参考资料。⁹至少一个产品批次必须通过此测试。

稳定性试验计划

CLSI EP25-A要求在任何测试开始之前建立稳定性测试计划。该计划记录了要测试的内容、实验方案和测试细节以及验收标准。该计划的典型预期要素包括:

产品标识
将进行哪种类型的稳定性研究
要测试的产品属性
每项试验的验收标准
要测试的产品批次数
用于测试的材料和实验设计
抽样计划(即如何从一批产品中选择有代表性的样品)
试验大纲

测试计划应该超出预期的稳定性持续时间。这将确保估计落在测试期间，没有外推，并考虑到考虑置信区间通常会导致比其他方法获得的更保守的稳定性估计。预计将使用足够的测试重复来确保稳定性估计的统计能力。

设计稳定性研究有两种基本方法。经典的方法是在第0天将产品放入所需的存储条件中，然后按照计划从存储中取出产品进行测试。此设计没有先决条件，并且在每个测试点之后可以获得临时结果。这种设计的一个缺点是易受研究期间测量过程变化的影响，以及由于仪器维护活动、试剂批次变化或组件失效而导致的测量过程变化的偏差。

另一种方法是同步设计。¹⁰在这里，产品也在第0天放入存储，但在计划的每一天，产品只是从存储中取出并放入假定的稳定存储条件(例如-70ºC)。在研究结束时，所有的产品样本都被随机抽取，并作为一个批次运行。相对于经典设计，这种设计极大地减少了测量过程的可变性和偏差。缺点是在最终测试点之前无法获得稳定性评估，并且必须提供稳定的临时存储条件。这种实验设计对于短时间的研究特别有用(例如，控制产品在使用中的稳定性)。

测量漂移示例

下面的例子，取自CLSI EP25-A⁸，说明了考虑统计置信度可能对通过测量漂移建立保质期稳定性产生的影响。

一种新的铁蛋白IVD试剂用于检测几种质量控制和人血清池样品，其浓度落在测定范围内，持续402天。在研究结束时，对每个样本的平均观察[铁蛋白]值与试验天数进行标准线性回归分析。除一个斜率外，其他斜率的p值均> 0.15，表明在测试期间没有显著变化。一个具有显著斜率(p < 0.001)的样品用于接近检测范围高端的血清池。

测量偏差接受标准为±5%。由于该样品的Day 0值为1855.0µg/L，因此观察到的铁蛋白浓度允许上限为1947.8µg/L。对数据进行绘制，并对回归线建立95%置信区间。使用单侧置信限，因为从以前的研究中预计观察到的结果会出现预期的正增加。在这个置信区间与最大允许铁蛋白浓度的交集处，确定了395天的稳定性估计。

CLSI EP25地块

图表取自CLSI。体外诊断试剂的稳定性评价批准的指导方针。CLSI文件EP25-A。Wayne, PA:临床和实验室标准研究所;2009.经许可转载。

如果忽略置信区间，则根据回归拟合统计量(斜率= 0.2011,y截距= 1855.0)计算稳定性估计为:

(允许漂移极限- y截距)/斜率=稳定性估计
(1947.8 - 1856.0)/0.2011 = 461天

正如预期的那样，使用置信区间会得到比其他方法更为保守的稳定性估计。

如何进行加速稳定性测试?

加速稳定性测试是指使用比正常情况下更有压力的存储条件，以便在比通常情况下更快的时间尺度上导致产品降解。这些研究可能对以下方面有用:

比较不同产品配方或包装选择的相对有效性
识别产品风险分析的不稳定性模式
评估变更对产品设计或制造的影响
提供产品稳定性的早期评估

加速测试的一个重要问题是，应力储存条件的应用可能会通过在正常储存条件下不会发生的机制导致产品不稳定。此外，并非所有产品都会遵循可预测的故障趋势，并且可能在故障时刻显示可接受的性能。

虽然加速测试在制定产品设计决策时非常有用，但监管机构的普遍期望是产品稳定性声明将基于实时数据。有些情况下，仅凭加速测试数据就足够了，但通常情况下，这些数据之后还要有实时研究的最终结果。良好的做法是首先与相关监管机构核实特定产品需要哪些稳定性数据。